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本制品由长度20～1000bp的10条dsRNA（双链RNA）片段组成，适用于非变性的PAGE电泳，不适用于变性PAGE电泳（尿素），也不建议用于琼脂糖电泳。可以用于制备siRNA（小干扰RNA）时标记双链RNA片段大小。

本dsRNA Ladder片段大小分别为20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000bp，其中100bp的双链RNA片段为增强带，显示亮带，可作为参照。

15％ TBE-PAGE电泳
左1：10bp DNA ladder(10～100bp，货号：RFT311) 5μL
左2：20bp DNA ladder(20～500bp，货号：RFT312) 5μL
左3：即用型dsRNA ladder(20～1000bp) 5μL （4μL 10bp dsRNA ladder加1μL 5×RNA上样缓冲液）
凝胶长度：8cm
电泳条件：稳压150V起始电流20 mA，终止电流10 mA
电泳缓冲液：1×TBE
电泳时间：50分钟
染色：RealGood Red核酸染料后染30分钟

组分	规格
dsRNA ladder(20～1000bp)	100μL
5×RNA上样缓冲液	1mL

保存：-20℃，有效期1年。


按照每次上样5μL计算，该产品配制好即用型产品可以使用约25次。

• 由于RNA极易污染后降解，实验操作时采取必要措施防止RNase污染，如佩戴一次性手套，使用专用RNase-free吸头及离心管等；不要在同一区域进行涉及RNase的实验，如质粒提取等。
  
• 由于dsRNA序列不同，显示的片段长度会略有不同；使用的siRNA片段中含有DNA片段时，片段大小会略有差异。

一、即用型dsRNA ladder(20～1000bp)配制方法

成分	即用型dsRNA ladder(20～1000bp)配制量
	5μL	10μL	15μL	20μL
dsRNA ladder(20～1000bp)	4μL	8μL	12μL	16μL
5×RNA上样缓冲液	1μL	2μL	3μL	4μL

• 即用型dsRNA Marker建议现用现配，不建议配制后保存，保存后会导致电泳后条带模糊。

二、TBE-PAGE凝胶制备

• 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
  
• 按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10% APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
  
  • dsRNA ladder(20～1000bp)适用于配制15% TBE-PAGE胶。
• 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。
  
• 静置10～20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
  表一：TBE-PAGE分离胶配方表(总体积5mL，适用于1mm厚度小板胶)
  

  最佳dsRNA分离范围	凝胶浓度	各组分体积(mL)
  		灭菌水	30%PAA(29:1)	5×TBE	10%APS	TEMED
  70～450bp	6%	3	1.0	1	0.05	0.005
  60～460bp	8%	2.66	1.34	1	0.05	0.005
  50～300bp	10%	2.33	1.67	1	0.05	0.005
  40～200bp	12%	2	2.0	1	0.05	0.005
  25～150bp	15%	1.5	2.5	1	0.05	0.005
  5～100bp	20%	0.66	3.34	1	0.05	0.005

• 去除覆盖在分离胶上的乙醇；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
  表二：TBE-PAGE 4%浓缩配方表(总体积1.5mL，适用于1mm厚度小板胶)
  

  凝胶浓度	各组份体积(mL)，总体积1.5mL
  	灭菌水	30%PAA(29:1)	5×TBE	10%APS	TEMED
  4%	1	0.2	0.3	0.02	0.002

• 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
  
• 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
  
  • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

三、电泳

• 将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入1×TBE电泳液，1mL吸头冲洗加样孔1～2次。
  
• 取待测样品，加入相应体积5×RNA上样缓冲液，如8μL样品加2μL上样缓冲液，短暂离心后取5～10μL上样。即用型10bp dsRNA ladder 1mm厚10齿梳子上样5μL，其余梳齿和厚度凝胶适量调整上样量。
  
• 连接电源线，打开电源开关。150 V稳压电泳，至溴酚蓝指示前沿距离玻璃下沿2cm时结束电泳（参见下图）。
  

  TBE-PAGE电泳
  恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间
  150V	15～25mA/板胶	8-15 mA/板胶	50+min

  
  15%T3.3C TBE-PAGE
  溴酚蓝前沿大小约15bp dsRNA，二甲苯菁大小约60bp dsRNA。

四、染色

• 漂洗：玻璃板上拆下凝胶后，适量蒸馏水漂洗3～5分钟。
  
• 染色液配制：
  TBE-PAGE胶可以使用EB或RealGood核酸染料后染染色，以下程序用RealGood红色核酸染料(货号：RFT232)进行染色。即用型染色液配制：
  

  成分	用量
  1×TBE	100mL
  RealGood红色核酸染料	20μL

• 染色和观察：
  凝胶浸泡于即用型染色液中，常温避光摇床40～60rpm染色30分钟。紫外光下观察。

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